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恩博推荐|肿瘤微环境的外泌体功能学研究
作者:ez    发布时间:2020-03-27

恩博推荐|肿瘤微环境的外泌体功能学研究



肿瘤转移是癌症治疗失败和患者死亡的主要原因,其分子机制复杂,涉及多步骤、多阶段、多基因的变化。作为肿瘤细胞赖以生存的场所,肿瘤微环境(Tumor Microenvironment,TME)在肿瘤转移过程中起到至关重要的作用。肿瘤微环境不但影响肿瘤转移的发生和发展,还会影响原发肿瘤的治疗疗效。

肿瘤微环境包含以下因素:

  • 基质细胞,如成纤维细胞(实体瘤微环境的主要细胞组分)、内皮细胞、网状细胞和脂肪细胞等;

  • 免疫细胞,如肥大细胞(MC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和髓源性抑制细胞(MDSCs)等;

  • 生理因素:如缺氧、PH等。

  • 胞外基质成分:如细胞因子、生长因子和外泌体等。


肿瘤细胞通过外泌体可对肿瘤微环境进行重塑,压力环境可调节外泌体的释放,进而导致TME的改变和扩张,最终产生肿瘤进展。

外泌体国自然申请中,聚焦在肿瘤微环境中的研究也非常多,如成纤维细胞、脂肪干细胞、巨噬细胞和缺氧等条件下的外泌体研究。下图列举了2019年外泌体国自然中部分TME相关项目。


那么肿瘤微环境结合外泌体的研究应该如何开展呢?其实总结起来,不同方向的外泌体功能学研究思路是高度相似的,无外乎从外泌体的功能现象、功能分子、功能验证和机制探讨四个层面展开(具体可收听外泌体大讲坛·第五期专题介绍)。


下面以成纤维细胞外泌体miRNA相关研究为例,恩博细细讲解。


研究背景

研究者之前的研究中鉴定到外泌体miR-200家族富集在高转移性乳腺癌细胞系4T1中,当其被受体细胞摄取后可增加受体肿瘤细胞的转移性,但抑制miR200后并不能完全逆转受体细胞转移性的增加,表明外泌体miRNA和疾病之间的关系是错综复杂的,而其中的miRNA并非是简单的分子标志物,应该是作为细胞间的信号和潜在的转录后修饰因子,可能在疾病进展中发挥重要的功能作用。因此本研究对EV-miRNA介导的乳腺癌和其微环境之间的交流进行机制研究。

研究方案



研究结果

1.乳腺肿瘤基质细胞和肺转移灶对肿瘤EVs的摄取

利用GFP-CD63标记和未标记的4TO7细胞(鼠)、CA1a(人)EVs同时注射SCID,消化原位和肺移植瘤,FACS检测不同细胞类型对EVs的摄取


肿瘤细胞中,发现:局部肿瘤微环境中成纤维细胞摄取最多(30%),远端转移处吸收的较少。在肿瘤细胞中,发现:30%肿瘤细胞CD63阳性,局部肿瘤微环境中成纤维细胞摄取最多(41.8%)。

为了确定肿瘤EVs的分布模式,构建了表达mCherry跨膜区转基因的CA1a细胞系,使细胞在质膜上有mCherry荧光,并在EVs中释放mCherry。流式检测发现微环境中60%细胞呈阳性,成纤维细胞的吸收最多。


综上,小鼠和人源肿瘤细胞中,成纤维细胞,包括CAFs,是EVs的主要受体细胞。转移微环境中,成纤维细胞是主要而非唯一的受体细胞。


2.转移性乳腺癌细胞系EVsmiR-125b的鉴定

4T1细胞和4TO7细胞及其分泌的EVs进行miRNA测序,最高表达的三个miRNA分别是miR-125bmiR-5099let-7a。进一步功能分析,发现:miR-5099为鼠源miRNA,在人中不保守;let-7a在诸多研究中属于抑癌miRNAmiR-125b在不同肿瘤类型中均是原癌miRNA。因此锁定miR-125b为目标miRNA


3.肿瘤EVs释放miR-125b及其被成纤维细胞摄取的鉴定

要对EVsmiR-125b进行功能分析,首先对外泌体分离纯化进行优化提升,作者结合了60%蔗糖垫的密度梯度离心+分子尺寸排阻(SEC分离纯化细胞上清的EVsEVs主要富集在7-11馏分,并通过TEMNTAWBCD63流式检测进行表征。

通过RNase ITriton X处理(用于检测目的分子是否受囊泡保护),发现miR-125b主要存在于膜内。PKH-26标记的4T-1-EVs和鼠耳部分离的原代成纤维细胞mATF共培养24h,观察摄取,发现:90-99%mATFs摄取了EVsmiR-125b呈高表达,其前体无变化。表明:miR-125b的上升并非内源性的表达上升,而是由于摄取了成熟的miR-125bCAF相关的标志物表达上调。此外,通过荧光素酶试验,证实了EVs包含功能性的miR-125b


4.乳腺癌EVs体内促进miR-125b依赖的成纤维细胞激活

要解决该研究目的,流程如下:

验证EVs对成纤维细胞活化的影响。实验方法4TO74T-1-EVs2.25*1011-4.5*1011)共同注射小鼠,3周后检测如下指标:肿瘤大小,CAF markerαSma免疫组化、CD140a+ fibroblasts在肿瘤组织中占比;结论4T1 EVs可以剂量依赖的方式促进成纤维细胞的活化。

验证4T1 EVsmiR-125b的功能。实验方法电转了ASO-miR-125b(实验组)或ASO-NC(对照)的4T-1-EVs4T07共同注射小鼠,qPCR检测miR-125b表达、流式检测成纤维细胞活化占比、IHC检测αSma表达;结果NC-ASO-loaded 4T1 EVs注射后的CD140a+成纤维细胞占比更高,αSma表达更高;125b-ASO-loaded 4T1 EVs,占比低,表达低。结论anti-miR-125b ASO抑制了4T1 EVs和内源性的miR-125b功能。


miR-125b对肿瘤进展的影响。实验方法mCherry标记的4TO7注射小鼠成瘤,分离肿瘤组织中的mCherry+成纤维细胞,电转ASO-miR-125b,之后与4TO7细胞按2:1比例注射到小鼠乳腺脂肪垫MFP3周后验证miR-125b表达,检测CAF marker, αSma,各免疫细胞数量,肺转移灶HE染色;结果125b-ASO可抑制成纤维细胞miR-125b的表达;成纤维细胞miR-125b敲降后显著抑制了肿瘤的生长,且肺部微转移灶面积明显降低,但对免疫细胞并无影响。结论miR-125b在激活成纤维细胞,促进肿瘤生长和转移上有重要作用。

5.miR-125b通过抑制Tp53inp1激活鼠成纤维细胞

为研究miR-125b下游调节机制。实验方法:mATFadult tissue fibroblasts)细胞中转入miR-125b mimics过表达NC mimic为对照,qPCR验证miR-125b表达,qPCR检测CAF markers,免疫荧光和WB检测αSmatranswell和划痕实验,qPCR检测p53网络里的各miR-125b靶标。结果:mATFmiR-125b过表达后,CAF相关标志物上调表达,增加了mATF的侵袭性,但迁移率上无影响,抑制了p53通路上的各靶标,其中Tp53inp1抑制表达最明显。而当敲降Tp53inp1后,CAF相关标志物显著上调。结论:Tp53inp1 miR-125b介导鼠成纤维细胞激活功能的关键靶标。

上面的功能表型和机制研究均针对鼠源乳腺癌细胞系4T14TO7)的功能机制研究,接下来针对人源乳腺癌细胞CA1aBPLERMB-231)以相同的思路再来一遍。


6.人乳腺癌细胞可分泌EVs miR-125b并转运至CAF

实验一:三种人源乳腺癌细胞系注射裸鼠成瘤,以无肿瘤小鼠对照,检测血循环中的miR-125b表达。结果:miR-125b存在于EVs中。

实验二mCherry标记CA1a细胞移植到小鼠MFP中,成瘤后分离肿瘤组织观察mCherry阳性和阴性的CD140a+ fibroblastsmiR-125bCAF markersαSma的变化。结果:肿瘤微环境中,44%CD140a+ fibroblastsmCherry阳性,表明其摄取了CA1a细胞的EVs,此外其中的miR-125bCAF各标志物显著上调。

结论fibroblasts摄取了CA1a肿瘤细胞的mCherry+ EVs,胞内miR-125b表达上调,促进其分化成CAFs


7. miR-125b通过抑制TP53INP1TP53激活人成纤维细胞

实验一:向hFTFfoetal tissue fibroblasts)细胞中转入miR-125b mimics,发现:miR-125bCAF相关标志物、αSma上调表达。

实验二敲除hFTF细胞中的TP53INP1TP53后,发现:CAF各标志物显著上调。

综上,可得出如下模型:乳腺癌细胞分泌的EVs,包裹miR-125b,转运至正常的成纤维细胞中,miR-125b通过抑制Tp53inp1TP53,促进正常成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞转化。



恩博点评

文章从细胞到动物多层次验证了外泌体作为载体传递关键miRNA对下游靶基因的调控,通过肿瘤微环境中的信号交流进而影响了受体细胞的转化,促进了肿瘤的病程发展。

其中应用到了两种外泌体功能学研究的经典实验方法,一是利用外泌体特有biomarker+荧光标记融合蛋白对外泌体进行摄取的定位追踪,另一个是通过电转ASO技术敲降EVs中目标miRNA的表达,这两种方法不仅直观,而且可操作性强,重复性好。此外文章应用到的许多其他研究方法在我们的实际外泌体实验中均可参考,例如共孵育的浓度和时间设置、动物实验的剂量控制、标志物筛选逻辑等。




重要提示

这样一归纳总结,是不是发现复杂高深的外泌体功能学研究其实也比较easy呢?如果还有问题欢迎来外泌体大讲坛做深入的沟通交流。此外,恩博家现在也可以提供外泌体功能学研究的整体服务哦。若有相关需求,欢迎垂询:010-69739599,或联系当地销售。


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