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系列推荐|外泌体标志物在肝部疾病中的研究应用
作者:恩泽康泰    发布时间:2020-04-28

所有细胞(真核和原核),在其正常或异常生理功能中均会释放细胞外囊泡(extracellular vesiclesEVs),直径范围约50nm1 mm。外泌体(exosomes)是一类直径范围约40-160 (平均约100nm,内涵体来源的经由多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外的EVs产生外泌体的生理目的,一种推测是为维持细胞稳态而去除不必要成分,此外大量研究表明外泌体中特定成分在细胞间通讯中发挥重要功能,并参与代谢、免疫等功能调控和各种疾病进展。

1 外泌体:体内细胞间多功能的转运系统外泌体负载核酸、蛋白(多肽)、脂质和代谢产物,参与正常或疾病和各种细胞生理功能中胞间通讯。The biology, function, and biomedical applications of exosomes.



外泌体在肝生理和肝脏疾病过程中同样扮演着多种角色。外泌体参与肝细胞与肝细胞间、肝细胞与其他肝组织细胞、肝脏与其他组织器官之间的物质运输和信息交流。外泌体介导的信号会导致如炎症、血管生成、增殖和组织重塑等多种肝脏生物学应答。因此外泌体在多种肝脏疾病中,如肝炎(包含非酒精性肝炎nonalcoholic steatohepatitisNASH;酒精性肝炎alcoholic hepatitisAH;和病毒性肝炎viral hepatitis)、药物诱导的肝损伤肝纤维化肝部恶性肿瘤,均发挥重要功能。

2 外泌体在肝生理和病理中的功能Extracellular Vesicles in liver pathobiologysmall particles with big impact.


下面我们将以5篇案例解析方式分析外泌体在上述疾病诊断和治疗预后上的biomarker研究工作


RECOMMEND

第1篇

1.循环细胞外囊泡鞘脂应用于酒精性肝炎诊断和动态风险评估

Hepatology2020,IF=14.97



研究背

酒精性肝炎30天死亡率为20-40%,主要诊断措施是肝病理活检,大量活检存在重症患者并发症风险。因此需要识别新的、可重复的、高效的非侵入性标志物。



入组方案

54健康对照、36重度酗酒者、29例非酒精性肝炎(NASH或原发性胆管炎PBC或原发性硬化胆管炎PSC)、30非酒精性肝硬化、76 AH血浆样本。





技术路线




关键结果

AH患者血浆中EVs升高且与疾病严重程度相关。高EVs浓度预示AH患者不良预后。AH患者EVs中多种鞘脂含量升高,且鞘脂来源并非脂蛋白。MELDModel for End Stage Liver Disease)评分和EVs鞘脂显示出较高诊断价值,AUC0.907优于单MELD0.856)和MELD联合EV浓度(0.859)。

(A) 健康对照、重度酗酒、酒精性肝硬化和酒精性肝炎病例血浆中EVs浓度。(B) 健康对照、NASHPBCPSCAH病例血浆中EVs浓度。(C)血浆中EVs高或低的AH病例90天死亡率。(D) 健康对照、重度酗酒、NASHPBCPSCAH病例血浆EVs中鞘脂含量热图和聚类分析。(E) MELD评分和MELD评分结合Log EVs浓度和MELD评分结合Log EVs6种鞘脂浓度COX单变量分析。

参考文献1Circulatingextracellular vesicles carrying sphingolipid cargo for the diagnosis anddynamic risk profiling of alcoholic hepatitis.




恩博点评

本文为了寻找AH中可重复的、高效的非侵入性标志物,比较了正常和相关肝病血浆中的EVs的浓度及鞘脂含量,发现循环EVs6种鞘脂可应用于AH诊断和动态风险评估。

本文的亮点是:逻辑十分严谨,研究中入组AH和相关多种疾病样本比对分析,血浆中差异鞘脂的来源确认为EVs而非脂蛋白;②EVs鞘脂作为生物标志物的优势有可重复高效非侵入,还有来自于脂蛋白的杂质干扰小、准确性高。



RECOMMEND

第2篇

2.血清细胞外囊泡在肝纤维化中的治疗研究

JEV2018,IF=11



研究背景

肝纤维化伴随着慢性肝病发展,大部分肝纤维化患者对慢性肝病疗法不敏感,肝纤维化疗法的缺乏严重限制慢性肝病患者医疗管理。血清中EVs是一种易于获取且丰富的评价器官疾病的生物标志物,而对健康人血清中EVs研究较少。


入组方案

(诱导肝纤维化模型)control组,oil组(对照溶剂),CCl4组小鼠血清各5例。HBV(乙型肝炎病毒,hepatitis B virus)伴随F3/4纤维化患者和相同年龄性别对照正常人血清样本各12例。




技术路线



关键结果

对分离的EVNEVF进行表征鉴定确认。EVN减少CCl4诱导的小鼠肝纤维化相关基因表达和肝纤维化程度。EVN抑制CCl4诱导的肝脏炎症反应。EVN更偏向结合肝脏中肝星状细胞(hepatic stellate cells HSC)和肝细胞,并在肝损伤时结合增加。EVNmiR-34c-3pmiR-151-3pmiR-483-5pmiR-532-5p miR-687差异表达显著,且上述5miRs抑制剂能消除EVN对损伤肝细胞的抗纤维化和抗增殖作用。正常人血清中EVs同样能抑制活化的肝星状细胞纤维化基因表达,且肝纤维化患者miR-34c-3pmiR-151-3pmiR-483-5pmiR-532-5p 表达显著降低。

(A) 正常雄性小鼠血清EVsEVN,左)和CCl4处理5周小鼠血清EVsEVF,右)的TEM (上)、NTA(下)和Western blot (中)鉴定结果。(B) CCN2-EGFP转基因小鼠梯度剂量注射CCl4EVFEVN,或对照oilIHC检测GFPαSMA表达。(C) CCN2-EGFP转基因小鼠注射CCl4 或对照oil,同时注射或不注射EVNSirius red (左)和H&E(右)染色结果。(D) 上述小鼠血清细胞因子蛋白芯片。(EPKH-26标记的EVN注射到对照或肝纤维化小鼠中检测荧光图像(上)和相应荧光强度统计(下)。(FEVNEVF中差异表达miRs热图。(GAML12肝细胞与EVN或对照共培养,加或不加5miRs抑制剂的增殖能力。(HLX-2细胞加入正常男性或女性血清EVs共培养后collagen α1(I) 基因表达定量。(IRT-PCR定量临床肝纤维化患者或对照miRs表达。

参考文献2Therapeutic effects ofserum extracellular vesicles in liver fibrosis.




恩博点评

本文的研究不同于一般的从疾病中筛选EVs标志物加上后续机制研究的策略,从正常血清EVs极可能具有的疾病治疗功能着手,然后进行治疗成分分析确定,最终在临床样本血清EVs中进行验证的工作极大提高本研究的价值。此工作预示了正常血清EVs对疾病治疗作用的物种保守性,且文中发现的EVN中差异miRNAs具有潜在的肝纤维化机制研究和治疗靶点价值。



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第3篇

3.血清细胞外囊泡蛋白作为胆管炎和胆管癌标志物

Hepatology2017,IF=14.97


研究背景

胆管癌(CholangiocarcinomaCCA)是高异质性恶性肿瘤,预后较差,原发硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitisPSC)是诱发CCA的高危因素。肝内PSCCCA的非侵入性鉴别诊断难度较大,目前还缺乏准确的无创方法区分PSCCCACCAHCC


入组方案

43CCA30PSC29例肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma HCC)和32例正常人血清。正常胆管上皮细胞NHCSV-40诱导永生化的胆管上皮细胞H69CCA细胞系EGI1TFK1培养上清。



技术路线




关键结果

对上述样本分离的EVs进行表征鉴定确认。蛋白质组图谱揭示了组间多个差异表达的蛋白质。这些蛋白中的几种显示出较高的诊断价值,AUC分别为CCA vs对照组0.878CCA I-II vs对照组0.905PSC vs对照组0.789CCA vs PSC 0.796CCA I-II vs PSC 0.956HCC vs对照组0.904CCA vs HCC 0.894FCN2ITIH4FIBG对早期CCAI-II)与PSC的区分能力较强(AUC分别为0.9560.8810.881)。SV-40诱导永生化的胆管上皮细胞H69分泌的EVs质谱结果更类似于CCA细胞EVsCCA细胞EVs差异蛋白GO分析突出大量参与癌症发展进程通路。在人CCA细胞构建的小鼠原位肿瘤模型分离的血清EVs蛋白中发现多种人源蛋白。

(A) CCAPSCHCCControl血清EVsTEM (左)、WB(中)和NTA(右)鉴定结果。(B) CCAPSC患者血清EVs差异蛋白热图(上)和诊断价值(下)。(C) 正常胆管上皮细胞NHCSV-40诱导永生化的胆管上皮细胞H69CCA细胞系EGI1TFK1培养上清EVs蛋白谱。(D) CCA细胞系和NHC培养上清EVs差异表达蛋白GO分析。(E) 小鼠人CCA细胞原位模型血清中EVsCCA培养上清EVs蛋白谱比对。

参考文献3Serum ExtracellularVesicles Contain Protein Biomarkers for Primary Sclerosing Cholangitis and Cholangiocarcinoma.


恩博点评

此研究预示了潜在的PSCCCA患者体液血清EVs蛋白质诊断标志物,蛋白作为标志物的优势在于较稳定且操作简单。并对部分研究中应用于CCAHCC蛋白标志物CA19-9重新进行评估。并且确认了CCA分泌的EVs能够在小鼠原位CCA模型血清中检测到,且CCA细胞分泌的EVs蛋白可能含有促癌蛋白质促进肿瘤的生长和转移。EVs蛋白验证工作比较难,本文另辟蹊径,以质谱的方式在细胞系和小鼠血清EVs层面进行了验证,整个工作涉及了大量的EVs质谱检测样本,包括不同肝部疾病的临床样本、不同细胞系的EVs样本。



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第4篇

4.血清和尿液细胞外囊泡RNA谱作为胆管癌诊断标志物

Cells2020,IF=5.65


研究背景

CCA发病率和死亡率迅速增加,在所有原发性肝癌中约占15%,胃肠道恶性肿瘤中约占3%CCA的常规诊断局限性明显,目前必须进行肿瘤活检以确认CCA的诊断和分期,非侵入性诊断具有挑战,且目前缺乏准确的生物标志物。


入组方案

血清样本:12CCA6PSC8例溃疡性结肠炎(ulcerative colitisUC)和9例健康人;

尿液样本:23CCA5PSC12UC5例健康人。



技术路线



关键结果

CCAPSCUC和健康个体血清尿液样本分离的EVs均进行了表征鉴定,发现血清和尿液EVs浓度、平均粒径在上述组别中并无显著差异。全转录组图谱揭示了组间多个差异表达的基因(mRNAncRNA,其中多个基因显示出较高的诊断价值。

CCA vs.PSC+ UC+ Healthy血清中差异表达的2807个转录本,有156 mRNA同时在TCGA肝组织、“Copenhagen”样本肝组织、NHCCCA细胞EGI1IFK1,对照NHC细胞)中差异表达,其中105 mRNA能在CCA细胞分泌的EVs中检测到,对105个mRNA进行GO分析发现多个参与致癌过程关键蛋白,并影响如细胞周期、有丝分裂、EMTDNA修复和端粒修复等过程。其中CMIPGAD1NME1CDS1CKS1B CCA vs.PSC+ UC+ Healthy的诊断性能AUC分别为0.9570.9280.8990.8930.891,是潜在的液体活检血清生物标志物。

CCA vs.PSC+ UC+ Healthy尿液中差异表达的1329个转录本,有84 mRNA同时在TCGA肝组织、“Copenhagen”样本肝组织、NHCCCA细胞中差异表达,其中39 mRNA能在CCA细胞分泌的EVs中检测到,对39 mRNA进行GO分析发现多个参与肿瘤发生发展过程关键蛋白,并影响如代谢(核酸和蛋白代谢)、信号转导、细胞通讯、EMT和免疫反应等过程。其中UBE2CSERPINB1 CCA vs.PSC+ UC+ Healthy的诊断性能AUC分别为0.7790.654,二者联合后的AUC0.812,是潜在的液体活检尿液生物标志物。

(A) 健康人血清(左)和尿液(右)中的EVsTEM (上)和WB(下)鉴定结果。(B) CCAPSCUC和健康个体血清EVs的全转录组差异基因热图。(C) 筛选的血清EVs差异表达基因GO功能富集分析。(D)血清EVs标志物的诊断判断(ROC曲线和AUC值)。(E) CCAPSCUC和健康个体尿液EVs的全转录组差异基因热图。(F) 筛选的尿液EVs差异表达基因GO功能富集分析。(G) 尿液EVs标志物的诊断判断(ROC曲线和AUC值)。

参考文献4Patients with CholangiocarcinomaPresent Specific RNA Profiles in Serum and Urine Extracellular VesiclesMirroring the Tumor Expression: Novel Liquid Biopsy Biomarkers for DiseaseDiagnosis.


恩博点评

本文从液体活检中应用价值高的两种体液(血清和尿液)着手,分析了CCA患者体液EVsRNA表达谱特征,筛选了可作为潜在CCA诊断生物标志物的基因,并确定多标志物联合分析的诊断价值。RNA作为诊断标志物的优势在于低水平也容易检测和量化。本文筛选得出的潜在生物标志物同时在CCA细胞系和其分泌的EVs表达谱中进行比对。但是本文并对血清或尿液中多标志物进行相关性分析和其表达量结合临床数据的多因素分析,其次是本文入组样本量较少无法排除个体差异对测序结果的影响,进而无法对筛选得到的生物标志物进行严谨的统计学判断。临床样本个体化差异非常大,权威推荐20例/组



RECOMMEND

第5篇

5.血浆外泌体lncRNAs预测HCC发生和转移

J CELL MOL MED2019,IF=4.65


研究背景

HCC(尤其是中国汉族人具有高HBVHCV感染率的背景下)是常见的肝部恶性肿瘤。现在肝癌诊断技术例如USCTMRI已经具有较高分辨率,但是仍然很难区分肝硬化患者直径2 cm以下的肿块。传统标志物如甲胎蛋白(alpha fetal protein AFP)检测灵敏度高但特异性低。有文献证明外泌体来源ncRNA可以作为各种人类肿瘤的诊断和预后预测,但大部分研究集中在miRs中。


入组方案

200 HCC患者、200慢性肝炎(chronic hepatitis CH)患者和200健康人对照(healthy controlNC)。测序入组NCCH、无转移HCCHCC without metastasis HCCN)和转移HCCHCC with metastasis HCCM)患者各3例。


技术路线


关键结果

分离上述样本血浆外泌体,并对阳性标志蛋白TSG101CD63CD9和阴性标志蛋白Calnexin进行WB鉴定确认。相对于NC组,CH81 lncRNAs高表达;相对于CH组,HCC-N179 lncRNAs高表达;相对于HCC-N组,HCC-M212 lncRNAs高表达。对上述比较交集的6lncRNAs进行qRT-PCR验证,发现 ENSG00000248932.1ENST00000440688.1ENST00000457302.2NCCHHCCNHCCM血浆外泌体表达依次升高,且差异具有统计学意义。且上述3 lncRNAs单独或单AFP或联合或联合并结合AFP进行ROC分析AUC分别为0.7760.6120.7200.4700.9600.970并且发现上述lncRNAs在室温放置24 h或反复冻融5次或-80 保存7天均较稳定

ANCCHHCC-NHCC-M血浆外泌体WB鉴定结果。(BNCCHHCC-NHCC-M血浆外泌体差异表达lncRNAs热图和聚类分析。(CCH/NCHCC-N/CHHCC-M/HCC-N之前差异基因韦恩图交集。(DC6差异lncRNAsNCCHHCC-NHCC-MqRT-PCR验证。(E-F3个潜在的lncRNAs生物标志物在training集(E)和validation集(F)中的ROC曲线。(G)健康人血浆在室温放置0-24 h或反复冻融5次或-80 保存7天后检测3个潜在的lncRNAs生物标志物表达。

参考文献5Circulating exosome-derived bona fidelong non-coding RNAs predicting the occurrence andmetastasis of hepatocellular carcinoma.


恩博点评

本文从NCCHHCC-NHCC-M临床样本入组筛选血浆外泌体差异lncRNAs作为用于HCC诊断和转移的非侵入性生物标志物,并基于大量临床样本进行了验证。本文确定的3lncRNAs ENSG00000248932.1ENST00000440688.1ENST00000457302.2显示出比AFP更高的敏感性和特异性,三者联合并结合AFP显示很高的诊断价值,lncRNAs的较稳定性也提升了其作为生物标志物的价值。但是本文中外泌体表征仅做了了WBNanoSight分析结果,另外很重要的一点是测序样本太少,不足以排除样本之间的背景差异,导致筛选中仅6个差异lncRNAs进入后续验证阶段。临床样本个体化差异非常大,测序样本需要足够量以排除个体差异,权威推荐20例/组



重要提示

从目前外泌体标志物在肝脏疾病中的研究看来,聚焦于诊断的研究偏多,样本比较好收集文章也比较好发,随着研究数量的增加,文章内容也更加丰富。外泌体标志物种类从RNA和蛋白质拓展到脂质等代谢物,研究深度也从少量样本的外泌体标记物筛选和验证工作延伸到大量样本的标志物筛选验证,并结合功能机制研究。但是,我们不难发现,跟临床治疗预后相关的研究很少跟治疗预后相关的外泌体标志物研究还有很大的空间,欢迎随时来找恩博沟通探讨。为了帮助加速各位老师们的研究,我们提供了从个性化的方案设计到外泌体分离鉴定外泌体RNA测序外泌体蛋白质组外泌体标志物的细胞功能以及外泌体PD-L1检测等一整套服务内容!

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