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组织外泌体的提取方法和研究应用
作者:恩泽康泰    发布时间:2020-05-22

EVs已成功地从血液、尿液和唾液等体液中分离出来,但直接从组织分离EVs的研究还很有限。组织样本直接分离的EVs相比于细胞系培养或者从体液中分离的EVs具有明显的优势。①首先,细胞系培养缺乏肿瘤微环境的复杂性,真实的肿瘤微环境中,肿瘤细胞、结构细胞和免疫细胞有相互作用。②其次,与细胞系来源的EVs相比,肿瘤组织来源EVs包含更丰富的信息来源,因为细胞系可能不能很好地代表肿瘤。③第三,虽然肿瘤EVs可以从体液中分离出来,但是它们将与其他细胞和器官来源的EVs混合在一起。通过从肿瘤组织中直接分离EVs,可以获得肿瘤最直接来源的EVs。因为这些EVs有分泌至各种体液循环的潜能,因此可以先获取组织EVs,找到有潜力的生物标志物,再回到血液验证标志物的性能,对于标志物发掘具有重要的意义。如果要进行组织EVs的分离提取,我们需要先解决几个问题:



1.组织间隙中是否有EVs



根据各路文献显示组织间隙中显然是存在EVs的,EVs在细胞间的通讯中发挥了至关重要的作用。

下图左为黑色素瘤组织的电镜图,在黑素瘤细胞中可见黑色结构,可能是黑色素。此外还存在其他小细胞,很可能是淋巴细胞。重要的是,还具有形态相似、不同大小的囊泡结构的EVs清晰可见。右图为前列腺癌组织的电镜图,白色箭头所指的即为前列腺癌组织间隙的EVs


前列腺癌组织和黑色素瘤组织EVs电镜图

参考文献1Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.

参考文献2Prostate-specific extracellular vesicles as a novel biomarker in human prostate cancer.




2.组织EVs怎么提取?


为了能够研究组织来源的EVs,我们就要开发一种可以直接从组织分离EVs的实验方法。一般,组织EVs提取的方法包括三个过程。首先组织切片,使组织具有更大的表面积其次,在细胞培养基中利用组织解离酶与组织切片孵育,目的是使组织EVs扩散到培养基中。最后,通过密度梯度离心、分子尺寸排阻等方法从培养基中分离EVs需要注意的是组织切片和组织消化过程中避免细胞的破碎,因为细胞破碎后会有大量的囊泡产生。

下面以人类黑色素瘤细胞组织EVs提取为例,细细讲解。



研究者采用了三种组织EVs提取方案,并比较了不同方案提取的EVs的效果,提取流程如下图所示:

三种肿瘤组织EVs提取流程

第一步:组织解离。组织称重后,轻轻切成小碎片(1-2mm)Protocol 1Protocol 2中是将组织碎片直接置于普通的RPMI-1640培养基中,37孵育30分钟。Protocol 3则是将组织碎片放置于含有collagenase D (2 mg/ml) DNase I (40 U/ml)RPMI-1640培养基中,37孵育30分钟。解离完成后,将解离溶液通过70μm的滤膜,除去大的组织碎片。

第二步:EVs分离纯化。将得到的滤液经300g*10min2000g*20min去除细胞和细胞碎片。Protocol 1Protocol 3的上清通过16,500g*20min获得大囊泡,经118,000g*2.5h获得小囊泡。而Protocol 2以相同的离心步骤得到的沉淀经collagenase D (2mg/ml) DNase I (40U/ml)孵育后获得大囊泡和小囊泡。所有离心均在4下完成。

研究者发现在第一步的组织解离过程中若不经过酶处理的Protocol 1Protocol 2在超速离心(16,500×g20min)和(118,000×g2.5h)后得到的沉淀很难经PBS重悬,Protocol 2通过将得到的沉淀以collagenase D (2 mg/ml) DNase I (40 U/ml)处理30min后,才完全被PBS重悬。如下图所示,Protocol 1Protocol 2虽然都可以得到EVs,但相比于Protocol3,Protocol 1Protocol 2丢失了大量的EVs

三种提取方法提取EVs的比较

因此,研究者最终采用了Protocol 3进行了接下来的试验。

研究者评价了collagenase D DNase I解离组织是否会影响EVs表面分子的表达(下图)。结果表明,CD63CD9的表达没有任何影响,相比之下,CD81的表达受到了比较小的影响。

大、小囊泡表面蛋白表达情况

研究者对获得的大囊泡和小囊泡进行了一系列特征分析(下图)。图aEVs电镜图,可见典型的囊泡结构。图b为根据电镜计算的EVs的大小,大囊泡的平均直径为142nm,小囊泡的平均直径为75nm。图d所示,NTA无法显示大、小囊泡的尺寸差异,直径分别为126nm122nm。图c分析了大、小囊泡的RNA组成,安捷伦2100显示,大囊泡含有小RNA以及18S28S核糖体RNA,相反小囊泡含有小RNA而没有核糖体RNA。图e,图f和图g以Western Blot显示了典型的EVs标志物flotillin-1CD63CD9CD81。此外,大、小囊泡中含有少量的血小板标志物CD41a,表明污染了很少血液来源的EVsTEMNTAWB2100都是我们外泌体项目必备的常规操作!)

超离获得的组织来源的大、小囊泡的表征

研究者进一步对大、小囊泡进行了密度梯度离心,进行不同EVs亚型的分析(下图)。将大、小囊泡分别与碘克沙醇混合后获得终浓度为45%的碘克沙醇溶液,接着样本上层依次覆盖35%, 30%, 28%, 26%, 24%, 22% 20%的碘克沙醇。样本通过超速离心(186,000g*16h4),大囊泡和小囊泡会在不同的密度层富集至纯度更高的EVs。离心结束后,大、小囊泡均可见两条明显的囊泡带,称为高浓度囊泡和低浓度囊泡。对分离的四个EVs亚型进行了TEMNTARNA组成分析。图a可见不管是大囊泡还是小囊泡均可得到密度不同的两条亚型。图b和图c显示,低密度大囊泡的直径大于低密度小囊泡,图b-d也显示高密度大囊泡和高密度小囊泡的直径最小且数量最少。图6e分析了囊泡的RNA组成,低密度大囊泡和低密度小囊泡均有核糖体RNA而高密度大囊泡和高密度小囊泡均无核糖体RNA。图f所示,所有的四个亚型均含有CD81CD63CD9

密度梯度离心获得的四个亚型的EVs的表征

研究者直接从黑色素瘤组织中分离EVs,并最终获得了4EVs亚型。使用的方法包括酶处理、差异离心和超速离心、密度梯度离心。这些EVs的亚型在大小和密度以及RNA组成方面都有不同。这对于EVs的功能研究或者标志物发掘具有重要的意义。





3.组织EVs有哪些应用?

本part将会以案例形式展开。


1st. 阿尔茨海默症相关研究

Alzheimer's & Dementia2020 IF=14.423 )

参考文献:Proteomic and biological profiling of extracellular vesicles from Alzheimer's disease human brain tissues.



入组方案

标志物发掘阶段:20例AD样本 vs.18例对照组织样本,质谱检测

标志物验证阶段:42例AD样本 vs.36例对照组织样本,ELISA验证



技术路线





主要结果

研究者直接从从20阿尔茨海默症(AD)患者18对照组大脑灰质中分离EVs,组织切成2-3mm后经木瓜蛋白酶解离,接着匀浆后通过差速离心和密度梯度离心获得组织EVs。分离的EVs通过TEMNTA分析得出,可以从脑组织中分离出EVs。接下来ELISA测定了EVs中总tau(t-tau)、苏氨酸181磷酸化tau (pT181tau)、丝氨酸199磷酸化tau(pS199tau)和丝氨酸396磷酸化tau(pS396tau),结果显示与对照组相比,AD患者来源的EVspS396tau显著升高。此外还观察到Aβ1-42在AD患者来源的EVs显著高于对照组织EVs。


AD患者和对照脑组织中分离的EVs及蛋白分析

aEVs分离方案示意图。b:左图为通过NTA分析,获得脑组织EVs数目,右图为EVs的直径。cEVs的电镜图,比例尺为100nmd:比较了总tau蛋白和磷酸化tau蛋白的含量。e:比较了Aβ1-40蛋白Aβ1-42蛋白的含量。f:脑组织匀浆和脑组织EVs的散点图。


研究者对分离的38个脑组织EVs进行蛋白质谱分析,比较了AD和对照来源的脑组织EVs的蛋白,共定量了949个蛋白,934个定量蛋白在AD组和对照组中均存在。有3个蛋白在对照组中有唯一表达,而AD组有12个蛋白有唯一表达。为了能够发现准确区分AD和对照组的蛋白质分子组合,使用机器学习方法对定量的蛋白质数据进行了分析。通过分析,得到了ANXA5VGFGPM6AACTZ四个蛋白的panel训练组的AUC达到了0.95,接着在测试组中进行了验证,检测AD患者准确率达到88% (AUC = 0.97)



机器学习模型识别阿尔茨海默病(AD)脑特异性细胞外囊泡(EV)生物标记分子

a:机器学习方法的工作流程。b:基于AUC选择最好的蛋白panel。c:4蛋白panel和随机选择蛋白panel的AUC和准确性差异。d:四个蛋白在AD和对照组表达量比较。e:GPM6A ,VGF与pS396tau和Aβ1-42的比较。f:ANXA5在AD和对照中表达比较以及随之不同分期表达量比较。



总结


研究者直接从AD脑组织和对照脑组织样本中分离得到的EVs。AD脑组织富集了Aβ和tau蛋白,通过EVs获得的定量蛋白数据,经过机器学习分为盲性和非盲性测试集。得到ANXA5、VGF、GPM6A和ACTZ蛋白panel,区分AD和对照样本具有88%的准确率,并进一步扩大样本量进行了组织EVs的蛋白验证。

本研究创新性的通过直接从AD脑组织和对照脑组织分离EVs,通过蛋白质谱和机器学习,确定了ANXA5、VGF、GPM6A和ACTZ的蛋白panel,具有应用于AD的进展管理的潜力。可惜的是在验证组中,通过ELISA检测脑组织的四个蛋白,仅检测到ANXA5,并未在血循环中进行验证。该文章为发现AD标志物提供了新的研究方法,具有重要意义。



2nd. 黑素瘤相关研究

Journal of Extracellular Vesicles2019 IF=11 )

参考文献:Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.

入组方案

发现集:5例黑色素瘤组织 vs.4种细胞系(HEK293T, TF1, HMC1MSCs,质谱检测

验证集:黑色素瘤患者(n = 21);卵巢癌患者(n = 62);乳腺癌患者(n = 13);健康对照组(n=6),ELISA验证





技术路线





主要结果

研究者直接从黑色素瘤组织中分离获得了EVs,并对分离的EVs通过TEM,核酸2100进行表征。首先通过组织切片的电镜结果,可以明显的看到组织间隙中EVs的存在。大EVs的大小为100–300 nm,而小EVs的大小为40–100 nm。大EVs除了含有小RNA外,还有明显的18S28S核糖体RNA,小EVs主要含有小RNA,几乎没有核糖体RNA


黑色素瘤组织间隙EVs的分离和鉴定

a:黑色素瘤组织切片的电镜图。bd:黑色素瘤分离的大EVs的电镜图和RNA2100结果。ce:黑色素瘤分离的小EVs的电镜图和RNA2100结果。


研究者接着对分离的5例黑色素瘤组织EVsMeT1-MeT5)和4个细胞系EVsHEK293T, TF1, HMC1MSCs)进行膜蛋白质谱检测。比较了组织EVs和细胞系EVs的膜蛋白差异,发现线粒体膜蛋白和内质网膜蛋白的比例都达到了25%以上,而通常情况下占比在6.9 ± 7.9%左右,通过对线粒体膜蛋白进一步分析发现了三个线粒体内膜蛋白COX6c, SLC25A22, MT-CO2具有较大的潜力。将这三个蛋白利用ELISA方法在黑色素瘤组织来源EVs和非黑色素来源的EVs上进行了验证。结果显示,黑色素瘤组织来源EVs中三个蛋白的含量明显高于非黑色素来源的EVs


EVs的蛋白质组学分析揭示了线粒体膜蛋白的存在

a:五个黑色素瘤组织来源的EVs (MeT1-MeT5)的膜蛋白用于比分析,红色数字代表至少四种EVs共有的蛋白;b:黑色素瘤来源的EVs和非黑色素瘤来源的EVs的比较,共有蛋白按相对丰度差10倍进行分类;c236个候选蛋白的亚细胞定位分析;d:线粒体膜蛋白的相对丰度,蓝色是用于验证的最后三个;e-gELISA方法对三个线粒体蛋白COX6c (e), SLC25A22 (f)MT-CO2 (g)进行验证。



研究者又检测了血浆EVs中线粒体蛋白。MT-CO2 COX6c可以在健康人和黑色素瘤患者血浆中可直接被检测到。同时在卵巢癌乳腺癌的血浆EVs中均可检测到MT-CO2COX6c的存在且相比与健康人具有明显量的升高。


血浆EVs表面的线粒体膜蛋白检测

(a-b):检测健康人和黑色素瘤患者血浆EVs中线粒体内膜蛋白MT-CO2 (a)COX6c (b)的水平。cELISA方法验证黑色素瘤组织来源的EVs和非黑色素瘤来源的EVs的膜蛋白。(d-f)检测血浆EVs中线粒体蛋白(MT-CO2COX6c)的水平,黑素瘤患者(n = 21) (d),卵巢癌患者(n = 62) (e),乳腺癌患者(n = 13) (f),健康对照(n=6





总结

研究者对黑素瘤组织EVs分离进行了研究,并进一步检测了其中的线粒体膜蛋白检,同时也在三个组织中进行了ELISA验证。在血浆样本中研究者直接跳过了EVs的分离,进行了血浆EVs线粒体蛋白MT-CO2 COX6c的验证,发现可以在健康人和黑色素瘤患者血浆EVs中直接被检测到。同时在卵巢癌和乳腺癌的血浆EVs中也检测到MT-CO2COX6c的存在且相比与健康人有明显量的升高。

但该研究也存在一处小缺陷,就是在标志物筛选时并未设置严格的对照组(正常组织样本)而是选择了细胞系作为control,在筛选逻辑上不够严谨。



重要提示

许多研究在标志物筛选中是从患者的体液中寻找外泌体生物标志物,但循环中的EVs来源广泛,而组织间质隙中分泌的外泌体可能最终会到达体液循环中,可在循环中进行定量或定性。因此直接从组织间隙中分离外泌体,是具有重要意义的研究方向,应用前景巨大。

需要指出的是,目前虽然有组织EVs研究的研究,但目前仍没有一个成熟的、标准的研究方法。例如,组织是否需要切碎、是否需要经过酶解、选择什么解离酶、之后的外泌体分离纯化用什么方法才可以得到浓度和纯度俱佳的外泌体......等等关键技术还需要摸索

那在此也想提前告诉大家一个好消息,恩博家研发的组织外泌体提取方法前期数据很优秀,很快即可与大家分享,感兴趣的或有需求的老师尽早与我们联系啦!


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