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外泌体标志物在肿瘤临床中的应用
作者:恩泽康泰    发布时间:2020-05-06

外泌体在肿瘤领域的研究是被报道最多的,其参与了肿瘤发生、发展的多个过程,包括促进血管生成、成纤维细胞激活、分化浸润、调节免疫、介导治疗耐药等各个方面。外泌体不仅能够作为标志物,同时还能够作为治疗手段以及药物载体用于肿瘤的治疗。本文主要聚焦于外泌体标志物在肿瘤临床中的应用,包括早期诊断、诊断分型、化疗预后、靶向治疗预后、免疫治疗预后、疗效监测、复发监控和转移预测等。

外泌体在肿瘤中的功能

参考文献:Exosomal miRNAs as cancer biomarkers and therapeutic targets.



下面恩博将从早期诊断诊断分型化疗预后靶向治疗预后免疫治疗预后疗效监测复发监控转移预测几个层面展开案例解析,希望能给各位研究者带来一些启发。


RECOMMEND

1st:早期诊断

1.早期诊断:血浆外泌体miRNA诊断早期结肠癌

JEV2019,IF=11


研究背景

结直肠癌是全球第三大肿瘤,其中70%位于结肠部位,被称为结肠癌。越来越多的研究表明外泌体内含物可以作为早期疾病诊断的标志物,而血浆外泌体作为早期结肠癌早期诊断的系统研究尚未被报道。


入组方案

筛选组:15例超早期结肠癌(TisN0M0)和10例非癌对照(其他消化系统疾病)miRNA-seq

验证组:58例早期结肠癌和76例非癌对照 (qPCR)


技术路线



关键结果

15例早期结肠癌与10例对照样本血浆外泌体miRNA测序分析结果显示两组间存在95个差异的miRNA,而且其中有60miRNATCGA中结肠癌与癌旁的差异存在交集。根据之前文献报道(在癌症血浆研究中被报道同时在结直肠癌种具有功能)在60个交集miRNA中选取了4miRNA,分别为Let-7b-3p, miR-150-3p, miR-145-3p, miR-139-3p。通过双酶消化实验:蛋白酶结合RNA酶消化实验证明本研究中的4miRNA是来源于囊泡,而非蛋白复合体结合的miRNA(证明目的分子是囊泡来源的实验方法。在扩大样本验证时,研究者同时比较了这4miRNA在血浆外泌体miRNA及血浆总miRNA中的诊断性能,结果显示血浆外泌体miRNA的诊断性能要明显优于血浆总miRNA,其四个标志物组合性能评估AUC分别为0.9320.793(详细解读)


a)外泌体差异miRNATCGA差异比较韦恩图;(b)与TCGA交集60miRNA在血浆外泌体中表达量热图;(c)血浆外泌体所有差异miRNA在测序数据中的诊断性能;(d)与TCGA交集60miRNA在测序数据中的诊断性能 d-e)采用蛋白酶和RNA酶消化前后外泌体miRNA及血浆miRNA PCR的比较结果 e-d)三标志物组合和四标志物组合在血浆外泌体miRNA和血浆总miRNA中的性能比较结果。

参考文献1Evaluation of circulating small extracellular vesicles derived miRNAs as biomarkers of early colon cancer: a comparison with plasma total miRNAs.





恩博点评

本文是一篇非常经典的外泌体标志物研究的案例,是恩博家与友谊医院共同合作产出的成功。该文之所以能够发表至JEV杂志主要有一下因素:首先不同于以往的诊断研究,本研究在样本入组时选取的结肠癌均为非常早期的TisN0M0样本,对照也非完全的健康人而是患有消化系统良性疾病的患者,非常贴合临床的实际应用场景;其次本研究严格按照ISEV的标准进行外泌体的鉴定实验(TEM/NTA/WB等),同时通过双酶消化实验证明了研究中的miRNA是来源于囊泡而非蛋白结合的miRNA,在这一点上很好的解决了ISEV比较关注的囊泡研究基础性问题;该研究首次在同一批样本内头对头的比较了血浆外泌体miRNA及血浆总miRNA在早期癌症中的诊断性能,表明了血浆外泌体miRNA相比血浆总RNA有更好的早期诊断潜能。



RECOMMEND

2nd:诊断分型

2.评估外泌体miRNA作为早期非小细胞肺癌的诊断标志物

(CCR,2017,IF=8.9)



研究背景

血浆、唾液、尿液等体液已经被证明是理想的疾病诊断来源,但是很少有研究发现外周血中肺腺癌和肺鳞癌的特异miRNA标志物。


入组方案

筛选组:16I期肺腺癌、10I期肺鳞癌、12例健康对照(miRNA-seq

验证组:10I期肺腺癌、10I期肺鳞癌、30例健康对照(qPCR

测试组:34I期肺腺癌、13I期肺鳞癌、13例健康对照(qPCR


技术路线




关键结果

筛选组的外泌体miRNA测序结果显示,肺腺癌vs.正常对照存在20个上调及31个下调的miRNA,肺鳞癌vs.正常对照存在15个上调及20个下调的miRNA。通过对验证组的qPCR验证,相对于正常对照肺腺癌有11个高表达和13个低表达的miRNA,肺鳞癌有6个高表达和8个低表达的miRNA。其中let-7, miR-21, miR-24 miR-486 4miRNA在肺腺癌和肺鳞癌中均存在差异,miR-181-5p, miR-30a-3p, miR-30e-3p miR-361-5p4miRNA是肺腺癌特异的差异miRNAmiR-10b-5p, miR-15b-5p miR-320b3miRNA是肺鳞癌特异的差异miRNA。进一步在测试组中评估这些miRNA的诊断性能,结果显示诊断非小细胞肺癌(包括肺腺癌和肺鳞癌)的AUC0.899,诊断肺腺癌的AUC0.936,诊断肺鳞癌的AUC0.911

Alet-7b-5p, miR-24-3p, miR-486-5p let-7e-5p4miRNART-PCR验证中的结果;(B) miR-181b-5pmiR-361-5pRT-PCR验证中的结果;(CmiR-320b RT-PCR验证结果;(DmiR-30a-3pmiR-30e-3p 验证结果;(EmiR-10b-5p,miR-15b-5p 验证结果(**p<0.01,***p<0.001). Flet-7b-5p, let-7e-5p, miR-24-5p miR-21-5p联合诊断NSCLCROC曲线;(GmiR-181-5p miR-361-5p联合诊断肺腺癌的ROC曲线;(HmiR-320b miR-10b-5p联合诊断肺鳞癌的ROC曲线。

参考文献2 Evaluation of tumor-derived exosomal miRNA as potential diagnostic biomarkers for early stage non-small-cell lung cancer using next-generation sequencing.



恩博点评

本研究首次揭示了血浆外泌体miRNA在诊断非小细胞肺癌中的潜在性能,同时鉴定出了肺腺癌与肺鳞癌特异的外泌体miRNA并进行了诊断性能的评估。



RECOMMEND

3rd:化疗预后

3.外泌体miRNA作为预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗抵抗的标志物

Epigenomics2019IF=4.4


研究背景

弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)占到所有非霍奇金淋巴瘤的35%~40%,患者的标准治疗是R-CHOP方案(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松,加上anti-CD20单克隆抗体-利妥昔单抗)。虽然50%的患者能够被治愈,但是有三分之一的患者体现难治或复发,主要因为化疗抵抗,目前尚未有有效方法来预测DLBCL的化疗敏感性。


入组方案

筛选组: DLBCL敏感细胞系外泌体*3  vs. 耐药细胞系外泌*3

验证组: 116 DLBCL患者(血清外泌体)


技术路线




关键结果


测序筛选得到耐药细胞系外泌体中上调miRNA 37个及下调miRNA 17个;从中选取4个显著上调的miRNA使用qPCR在细胞系外泌体中进行验证,其中miR-99a-5p miR-125b-5p存在显著差异,而miR-10a-5p miR-10b-5p不存在显著差异。进一步在116例DLBCL中进行验证,结果显示miR-99a-5p和 miR-125b-5p在化疗抵抗组中显著高表达。对miR-99a-5p、miR-125b-5p和IPI评分进行性能评价(区分化疗抵抗和敏感),单独AUC分别为0.744、0.7802和0.6308;其中miR-99a-5p与IPI评分组合AUC为0.8326,miR-125b-5p和IPI评分组合AUC为0.8143。在116例患者中以miR-99a-5p和 miR-125b-5p表达水平的中位数为阈值,其高表达与低表达组患者的PFS存在显著差异(p<0.001)。

A)耐药与敏感细胞系外泌体miRNA差异表达热图;(B)在细胞系外泌体中qPCR验证结果;(C)在临床样本中qPCR验证结果;(C-AC-BmiR-99a-5p miR-125b-5p表达水平的中位数为阈值,其高表达与低表达组患者的PFS曲线。

参考文献3 Exosome-derived miRNAs as predictive biomarkers for diffuse large B-cell lymphoma chemotherapy resistance.


恩博点评

本研究从细胞系出发筛选biomarker并在患者群体内进行验证,一定程度上降低了标志物筛选成本,但是同样也伴随一定的风险




RECOMMEND

4th:靶向治疗预后

4.外泌体miRNA在多发性骨髓瘤中的预后价值

Blood2017,IF=16



研究背景

多发性骨髓瘤(MM)是一种血液恶性肿瘤,其特征是在骨髓微环境中血细胞的克隆增殖。其临床和生物异质性导致了药物治疗的不同治疗反应和结果。因为治疗选择的多样性,对MM患者的预后进行分层有助于病人的个体化治疗,改进患者的生存期。



入组方案

筛选组:10例多发性骨髓瘤患者,5例健康对照 miRNA-seq

验证组:156例多发性骨髓瘤患者,在靶向治疗药物硼替佐米联合地塞米松治疗前采集血清 qPCR




技术路线


关键结果

根据测序筛选并结合之前测序研究中与多发性骨髓瘤的生物相关性确定22miRNApanel进行156人队列的RT-PCR验证,并与其临床PFSOS进行关联分析,结果显示其中let-7b miR-18a无论是在单因素还是多因素统计分析中均与PFSOS显著相关。

A)筛选的22个差异miRNA在测序数据中的表达水平;(B22个差异miRNA相互之间的关系;(C~Flet-7b miR-18aPFSOS曲线

参考文献4Prognostic role of circulating exosomal miRNAs in multiple myeloma.




恩博点评

本研究内容很简单,但入组样本较多,随访时间长至5年,是本文能够发到blood的重要因素。所以有样本库或临床试验存留的样本,结合外泌体研究是个非常不错的选择




RECOMMEND

5th:免疫治疗预后

5.免疫治疗预后:血浆外泌体miRNA与非小细胞肺癌免疫治疗有效性的关系

Immunother Cancer, 2020IF=8.7


研究背景

免疫治疗已成为晚期非小细胞肺癌患者的一个重要治疗选择,而现有的生物标志物不能有效的对患者免疫治疗反应进行分层,迫切的需要找到更有效的生物标志物来预测免疫治疗预后。外泌体标志物已经被报道可以用于早期肺癌的诊断,本研究希望探索血浆外泌体miRNAEGFR/ALK阴性的患者免疫治疗中预后的相关性。



入组方案

EGFR/ALK阴性并进行抗PD-1/PD-L1免疫治疗的患者,其中5PR患者的基线血浆、4PD患者基线血浆、4PR患者的治疗后血浆及7例健康人血浆。


技术路线



关键结果

PRPD患者的差异比较中采用阈值logCPM>4, p<0.05, FDR≤0.1,筛选到4个与预后显著相关的miRNA has-miR-320d、has-miR-642a-3p、hsa-miR-320chsa-miR-320b。将样本分为4组:健康对照(H)、PR患者治疗前(PR-pre)、PD患者治疗前(PD-pre)及PR患者治疗后(PR-post,比较这4miRNA的差异,显示hsa-miR-320d、hsa-miR-320c和hsa-miR-320bPD-pre中相比其他三组显著上调,而hsa-miR-642a-3p没有显著差异。结果表明hsa-miR-320d,hsa-miR-320chsa-miR-320b的高表达可能与抗PD-1免疫治疗的不良响应相关。

A)临床治疗路径及样本情况;(Table 1PDPR组差异外泌体miRNA BmiR-320d在不同组间的表达水平; CmiR-542a-3p在不同组间的表达水平

参考文献5Correlation of plasma exosomal microRNAs with the efficacy of immunotherapy in EGFR/ALK wild-type advanced non-small cell lung cancer.



恩博点评

本研究入组的样本数量并不多,并且仅仅做了测序没有做PCR验证,但是因为紧跟治疗研究的热点领域,所以还是发到了比较好的水平。所以有免疫治疗相关的样本,很值得尝试一下外泌体方面的工作。





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6th:疗效监测

6.疗效监测:血浆外泌体miRNA作为霍奇金淋巴瘤治疗监测的标志物

JCI Insight, 2016IF=6.0



研究背景

cfRNA,包括miRNA,可以作为癌症患者治疗监测的无创标志物,然后大多数血浆miRNA是与蛋白结合的形式存在,只有一小部分是以囊泡包裹的形式存在,本研究针对性的研究血浆外泌体miRNA经典奇金淋巴瘤(cHL)治疗反应监测标志物的潜力。



入组方案

筛选组:6个细胞系来源外泌体 + 3cHL vs. 3例健康对照

验证组:20 cHL +9例健康对照+4SLE(非癌症对照)



技术路线




关键结果

根据细胞系外泌体及患者血浆外泌体的测序数据以及已发表文献筛选到外泌体miR127-3p, miR155-5p, miR21-5p, let7a-5pmiR24-3p可能可以作为cHL的无创标志物。进一步的在20cHL和9例健康对照、4SLE对照患者中检测上述miRNA的表达水平,结果显示这5个血浆外泌体miRNAcHL患者中均存在显著高表达。同时在总血浆miRNA中检测miR127-3p, miR155-5p的表达水平,显示miR127-3p在血浆总miRNA中不存在显著差异,miR155-5p虽然在血浆总miRNA中存在差异但是差异倍数没有血浆外泌体中明显

进一步的在有完整影像学随访的患者治疗前后检测血浆外泌体miR127-3p, miR155-5p, miR21-5p, let7a-5p的表达水平并与影像学进程进行联合分析:结果表明在治疗持续获益的患者中,这4miRNA的表达水平在治疗后持续维持低水平,而在治疗后复发进展的患者中,外泌体miRNA的表达水平与影像学进展显著相关,这4miRNA在复发的随访点表达水平显著提升。以上信息很好的表明外泌体miRNA可以作为cHL(经典霍奇金淋巴瘤)治疗监测的标志物。

A)患者x治疗前及治疗2个月和4个月影像学检测结果;(B-E) miR127-3p, miR155-5p, miR21-5p, let7a-5p在分别对应时间点检测的表达水平;(F)患者y治疗前和治疗7个月和12个月影像学检测结果;(G-JmiR127-3p, miR155-5p, miR21-5p, let7a-5p在分别对应时点检测的表达水平

参考文献6Plasma vesicle miRNAs for therapy response monitoring in Hodgkin lymphoma patients.




恩博点评

本研究虽然入组的临床样本并不多,但是结合细胞系+临床样本+已发表文献等多维度比较精准的筛选到cHL相关的标志物,并最终回归到临床样本,在患者血浆外泌体中进行了验证。再结合多点采集血浆和随访的少量病例很好的建立了外泌体miRNA可以作为cHL疗效监测标志物这一假设。但本研究中入组样本较少,有待进一步对更多随访样本进行验证。



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7th:复发监控

7.复发监控:尿液外泌体LncRNA作为膀胱癌诊断和复发预测的标志物

Mol Cancer, 2018IF=10.67



研究背景

膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤,大概有75%的患者为非浸润性膀胱癌(NMIBC),而NMIBC的特异是复发率超高。目前膀胱癌复发检测主要依赖于膀胱镜,而膀胱镜相对有创,因此迫切需要无创的膀胱癌复发检测的手段。本研究探索尿液外泌体LncRNA作为膀胱癌诊断及复发标志物的潜力。




入组方案

训练集:104例膀胱癌患者(BC)、104例健康对照(qPCR

验证集:80例膀胱癌患者、80例健康对照(qPCR)


技术路线



关键结果

根据已发表文献筛选与膀胱癌肿瘤发生相关的LncRNA 8个分别为:MALAT1, PCAT-1, SPRY4-IT1, UCA1,MEG3, H19, UBC1TUG1。在训练集104例BC  vs. 104例HC)尿液外泌体中采用RT-PCR对上诉8LncRNA进行验证,结果显示MALAT1, PCAT-1 SPRY4-IT13LncRNA在膀胱癌患者尿液外泌体中显著上调(p<0.001),且在训练集中MALAT1, PCAT-1 SPRY4-IT1AUC分别为0.844(95% CI = 0.787 ~ 0.890, 灵敏度 = 72.1% & 特异性 = 84.6%),0.832 (95% CI = 0.774 ~ 0.880, 灵敏度 = 72.1% & 特异性= 81.7%) and 0.760 (95% CI = 0.696 ~ 0.817, 灵敏度 =66.3% & 特异性 = 76.9%)。在测试集中(80BC vs 80HC),MALAT1, PCAT-1 SPRY4-IT1对应的AUC分别为0.7850.8100.799三个LncRNA组合在训练集和测试集中的性能分别为0.8540.813,显著高于尿液细胞学检测的AUC 0.619。对验证集中的BC患者进行随访,观测其复发时间,结果显示针对NMIBC患者,尿液外泌体MALAT1PCAT-1高表达的患者具有更低的RFSp=0.002p=0.001)(无复发生存时间),而针对MIBC患者,这三个LncRNA与其复发均没有相关性(p>0.05)。表明MALAT1PCAT-1可以作为非浸润性膀胱癌(NMIBC)复发监控的标志物。

AMALAT1, PCAT-1 SPRY4-IT13LncRNA组合在训练集中的诊断性能ROC曲线;(BMALAT1, PCAT-1 SPRY4-IT13LncRNA组合在测试集中诊断性能ROC曲线;(C)常规尿液细胞学检测在测试集中诊断性能ROC曲线; DMALAT1NMIBC中的RFS曲线;(EPCAT-1NMIBC中的RFS曲线

参考文献7Expression signatures of exosomal long non-coding RNAs in urine serve as novel non-invasive biomarkers for diagnosis and recurrence prediction of bladder cancer.



恩博点评

本研究是一篇Letter,内容相对较为简单。针对已知的标志物在尿液外泌体里面进行性能验证,入组的验证样本数量也相对较多。



RECOMMEND

8th:转移预测

8.转移预测:血清外泌体蛋白作为预测非小细胞肺癌转移的标志物

Cancer Sci,2018IF=4.7)



研究背景

非小细胞肺癌(NSCLC)是一种最常见的肺癌,占到总肺癌的大约85%,其根据病理学特征可以分为几个子类,其中包括腺癌和鳞状细胞癌等。本研究目的在于研究转移和非转移非小细胞肺癌中外泌体蛋白组的总体差异,并评估血清外泌体蛋白标志物预测非小细胞肺癌转移的能力。


入组方案

筛选集:5NSCLC远端转移(骨转移、脑转移等)、5例未转移NSCLCI-IIIa期)及5例健康对照

验证集:51例转移性NSCLC 51例未转移NSCLC51例健康对照

测试集:89例转移性NSCLC94例未转移NSCLC90例健康对照


技术路线



关键结果

血清外泌体质谱总共鉴定到628个蛋白,其中552被定量。质谱数据分析得到非转移和转移NSCLC之间存在61个差异蛋白(15个上调、46个下调),而NSCLC相对健康人存在43个差异蛋白(34个上调和9个下调)。根据上述结果结合功能分析候选蛋白进一步缩小,并选择差异最显著的蛋白LBP,其在NSCLC与健康人中的差异倍数为2.574,在转移NSCLC与非转移NSCLC中差异倍数为1.845。在验证集中对LBP蛋白(以HSP70作为参照)进行WB检测,结果显示在转移NSCLC患者中,LBP的水平要显著高于非转移NSCLC及健康对照。进一步在测试集中使用ELISA对外泌体LBP的水平进行检测,结果同样显示转移NSCLC中外泌体LBP的水平显著高于非转移NSCLC及健康对照,且区分转移性NSCLCAUC0.803(灵敏度83.1%,特异性67%)。同时对血清中LBP水平进行检测,虽然在转移组中存在一定差异,但是差异显著性及差异倍数低于血清外泌体中的LBP水平,其区分转移NSCLCAUC也仅为0.683,低于血浆外泌体的LBP水平。

A)在验证集中外泌体LBP蛋白WB检测结果;(B)在肺腺癌和肺鳞癌中外泌体LBP表达水平ELISA检测结果;(C)基于外泌体LBP表达水平区分肺腺癌和肺鳞癌的ROC曲线;(D)外泌体LBP在不同组之间表达水平的比较;(E)外泌体LBP水平区分NSCLC与健康人的ROC曲线;(F)外泌体LBP水平区分转移与非转移NSCLC患者的ROC曲线; G)血清LBP水平在不同组之间表达水平的比较;(H)血清LBP水平区分NSCLC与健康人的ROC曲线;(I)血清LBP水平区分转移与非转移NSCLC患者的ROC曲线;

参考文献8Circulating exosomes contain protein biomarkers of metastatic non-small-cell lung cancer.



恩博点评

本研究有些可惜,入组样本量很大,但是其筛选组做质谱样本量较少且并未对不同转移部位进行细致的分组,探究不同转移部位是否存在特异差异,腺癌和鳞癌也并未进行区分。而且最后的验证和测试集也仅仅针对LBP一个蛋白进行研究,造成了本研究的局限性。



重要提示

首先要谢谢您划到了最后,恩博的呕心之作得到了您的浏览,更希望能对您有所启发,并且在您需要做外泌体时希望能想起恩博,您需要的刚好是我专业的。

此外,从以上研究中不难看出:都是以临床样本为主结合外泌体标志物来解决临床问题。要做好一项外泌体标志物的临床研究要关注以下四个问题:1临床问题的设计2样本分组及入组样本数量3外泌体技术路线的选择及质控4标志物的验证。只要您有合适的临床问题和样本,其他方面恩博都有非常丰富的经验来给您提供优质的解决方案。为了帮助加速各位老师们的研究,我们提供了从个性化的方案设计外泌体分离鉴定、外泌体RNA测序、外泌体qPCR检测外泌体蛋白质组外泌体标志物的细胞功能以及外泌体PD-L1检测等一整套服务内容!


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