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组织外泌体的提取和研究应用
作者:小恩    发布时间:

EVs已成功地从血液、尿液和唾液等体液中分离出来,但直接从组织分离EVs的研究还很有限。组织样本直接分离的EVs相比于细胞系培养或者从体液中分离的EVs具有明显的优势。①首先,细胞系培养缺乏肿瘤微环境的复杂性,真实的肿瘤微环境中,肿瘤细胞、结构细胞和免疫细胞有相互作用。②其次,与细胞系来源的EVs相比,肿瘤组织来源EVs包含更丰富的信息来源,因为细胞系可能不能很好地代表肿瘤。③第三,虽然肿瘤EVs可以从体液中分离出来,但是它们将与其他细胞和器官来源的EVs混合在一起。通过从肿瘤组织中直接分离EVs,可以获得肿瘤最直接来源的EVs。因为这些EVs有分泌至各种体液循环的潜能,因此可以先获取组织EVs,找到有潜力的生物标志物,再回到血液验证标志物的性能,对于标志物发掘具有重要的意义。如果要进行组织EVs的分离提取,我们需要先解决几个问题:


1.组织间隙中是否有EVs



根据各路文献显示组织间隙中显然是存在EVs的,EVs在细胞间的通讯中发挥了至关重要的作用。

下图左为黑色素瘤组织的电镜图,在黑素瘤细胞中可见黑色结构,可能是黑色素。此外还存在其他小细胞,很可能是淋巴细胞。重要的是,还具有形态相似、不同大小的囊泡结构的EVs清晰可见。右图为前列腺癌组织的电镜图,白色箭头所指的即为前列腺癌组织间隙的EVs


前列腺癌组织和黑色素瘤组织EVs电镜图

参考文献1Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.

参考文献2Prostate-specific extracellular vesicles as a novel biomarker in human prostate cancer.




2.组织EVs怎么提取?

为了能够研究组织来源的EVs,我们就要开发一种可以直接从组织分离EVs的实验方法。一般,组织EVs提取的方法包括三个过程。首先组织切片,使组织具有更大的表面积其次,在细胞培养基中利用组织解离酶与组织切片孵育,目的是使组织EVs扩散到培养基中。最后,通过密度梯度离心、分子尺寸排阻等方法从培养基中分离EVs需要注意的是组织切片和组织消化过程中避免细胞的破碎,因为细胞破碎后会有大量的囊泡产生。

下面以人类黑色素瘤细胞组织EVs提取为例,细细讲解。


研究者采用了三种组织EVs提取方案,并比较了不同方案提取的EVs的效果,提取流程如下图所示:

三种肿瘤组织EVs提取流程

第一步:组织解离。组织称重后,轻轻切成小碎片(1-2mm)Protocol 1Protocol 2中是将组织碎片直接置于普通的RPMI-1640培养基中,37孵育30分钟。Protocol 3则是将组织碎片放置于含有collagenase D (2 mg/ml) DNase I (40 U/ml)RPMI-1640培养基中,37孵育30分钟。解离完成后,将解离溶液通过70μm的滤膜,除去大的组织碎片。

第二步:EVs分离纯化。将得到的滤液经300g*10min2000g*20min去除细胞和细胞碎片。Protocol 1Protocol 3的上清通过16,500g*20min获得大囊泡,经118,000g*2.5h获得小囊泡。而Protocol 2以相同的离心步骤得到的沉淀经collagenase D (2mg/ml) DNase I (40U/ml)孵育后获得大囊泡和小囊泡。所有离心均在4下完成。

研究者发现在第一步的组织解离过程中若不经过酶处理的Protocol 1Protocol 2在超速离心(16,500×g20min)和(118,000×g2.5h)后得到的沉淀很难经PBS重悬,Protocol 2通过将得到的沉淀以collagenase D (2 mg/ml) DNase I (40 U/ml)处理30min后,才完全被PBS重悬。如下图所示,Protocol 1Protocol 2虽然都可以得到EVs,但相比于Protocol3,Protocol 1Protocol 2丢失了大量的EVs

三种提取方法提取EVs的比较

因此,研究者最终采用了Protocol 3进行了接下来的试验。

研究者评价了collagenase D DNase I解离组织是否会影响EVs表面分子的表达(下图)。结果表明,CD63CD9的表达没有任何影响,相比之下,CD81的表达受到了比较小的影响。

大、小囊泡表面蛋白表达情况

研究者对获得的大囊泡和小囊泡进行了一系列特征分析(下图)。图aEVs电镜图,可见典型的囊泡结构。图b为根据电镜计算的EVs的大小,大囊泡的平均直径为142nm,小囊泡的平均直径为75nm。图d所示,NTA无法显示大、小囊泡的尺寸差异,直径分别为126nm122nm。图c分析了大、小囊泡的RNA组成,安捷伦2100显示,大囊泡含有小RNA以及18S28S核糖体RNA,相反小囊泡含有小RNA而没有核糖体RNA。图e,图f和图g以Western Blot显示了典型的EVs标志物flotillin-1CD63CD9CD81。此外,大、小囊泡中含有少量的血小板标志物CD41a,表明污染了很少血液来源的EVsTEMNTAWB2100都是我们外泌体项目必备的常规操作!)

超离获得的组织来源的大、小囊泡的表征

研究者进一步对大、小囊泡进行了密度梯度离心,进行不同EVs亚型的分析(下图)。将大、小囊泡分别与碘克沙醇混合后获得终浓度为45%的碘克沙醇溶液,接着样本上层依次覆盖35%, 30%, 28%, 26%, 24%, 22% 20%的碘克沙醇。样本通过超速离心(186,000g*16h4),大囊泡和小囊泡会在不同的密度层富集至纯度更高的EVs。离心结束后,大、小囊泡均可见两条明显的囊泡带,称为高浓度囊泡和低浓度囊泡。对分离的四个EVs亚型进行了TEMNTARNA组成分析。图a可见不管是大囊泡还是小囊泡均可得到密度不同的两条亚型。图b和图c显示,低密度大囊泡的直径大于低密度小囊泡,图b-d也显示高密度大囊泡和高密度小囊泡的直径最小且数量最少。图6e分析了囊泡的RNA组成,低密度大囊泡和低密度小囊泡均有核糖体RNA而高密度大囊泡和高密度小囊泡均无核糖体RNA。图f所示,所有的四个亚型均含有CD81CD63CD9

密度梯度离心获得的四个亚型的EVs的表征

研究者直接从黑色素瘤组织中分离EVs,并最终获得了4EVs亚型。使用的方法包括酶处理、差异离心和超速离心、密度梯度离心。这些EVs的亚型在大小和密度以及RNA组成方面都有不同。这对于EVs的功能研究或者标志物发掘具有重要的意义。





3.组织EVs有哪些应用?

本part将会以案例形式展开。


1st. 阿尔茨海默症相关研究

Alzheimer's & Dementia2020 IF=14.423 )

参考文献:Proteomic and biological profiling of extracellular vesicles from Alzheimer's disease human brain tissues.





入组方案

标志物发掘阶段:20例AD样本 vs.18例对照组织样本,质谱检测

标志物验证阶段:42例AD样本 vs.36例对照组织样本,ELISA验证





技术路线





主要结果

研究者直接从从20阿尔茨海默症(AD)患者18对照组大脑灰质中分离EVs,组织切成2-3mm后经木瓜蛋白酶解离,接着匀浆后通过差速离心和密度梯度离心获得组织EVs。分离的EVs通过TEMNTA分析得出,可以从脑组织中分离出EVs。接下来ELISA测定了EVs中总tau(t-tau)、苏氨酸181磷酸化tau (pT181tau)、丝氨酸199磷酸化tau(pS199tau)和丝氨酸396磷酸化tau(pS396tau),结果显示与对照组相比,AD患者来源的EVspS396tau显著升高。此外,还观察到A

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